La scarsa resa economica legata al prevalente uso attuale della farina di carrube nel settore mangimistico unitamente all’alto costo della raccolta, stanno mettendo in serie difficoltà il mantenimento sul territorio della pianta in oggetto nonché lo sfruttamento dei suoi frutti.

Per arrestare tale processo sono stati messi in atto programmi di ricerche pilota allo scopo di rendere possibile l’utilizzo della farina ottenuta dalla polpa dei frutti di carrube nella creazione di prodotti più utilizzabili nell’alimentazione umana. Poiché una delle limitazioni all’uso delle suddette farine è rappresentata dall’eccesso di astringenza dovuta ai tannini, si sta cercando
di eliminare in parte tali componenti, che per inciso dopo estrazione possono rappresentare sotto-prodotti ad alta valenza economica, con l’intento di ottenere sfarinati di carrubo più palatabili.

Dal punto di vista tecnico, infatti, la farina di carrube contiene circa il 20% di sostanze polife-noliche rappresentate in gran parte da tannini, alcuni dei quali trovano oggi impiego nel trattamento delle patologie degenerative dovute all’eccesso di radicali liberi e nella prevenzione di alcune patologie neoplastiche.

 SCOPO DELLA RICERCA

Le ricerche da noi proposte si basano sullo sviluppo in Sicilia ed in Sardegna di una filiera agroindustriale per la produzione di farine utilizzabili nel settore alimentare, nella prevenzione delle patologie degenerative da radicali liberi e nell’estrazione di sostanze tanniche utilizzabili nel settore della attività chemopreventiva dei tumori fondata sulla conservazione e sul miglioramento della coltivazione del carrube (Ceratonia siliqua L).

I nostri studi si sono proposti di analizzare a fondo le caratteristiche della farina di carrube con il particolare intento di classificare i tannini presenti e di mettere in atto gli opportuni accorgimenti per la loro estrazione. I tannini estratti dalle farine potrebbero trovare utilizzazioni industriali nella creazione di prodotti “no-food” utilizzabili a scopo salutistico. Esperimenti preliminari concementi l’applicazione di nuove tecniche estrattive di tipo chimico (solventi organici) o fisico (es. apparecchi a COz supercritica, strumenti per la nanofiltrazione) sono già in atto.

Le farine così ottenute dopo il depauperamento dei tannini potrebbero essere indirizzate alla creazione di prodotti dietetici anche in considerazione del loro alto contenuto di fibre (circa il 4%) oggi molto ricercate per i benefici effetti svolti sulla peristalsi intestinale e per il loro effetto inibente sull’assorbimento dei grassi.

Per quanto concerne i tannini va precisato che essi rappresentano dei polifenoli complessi classificati in due grandi gruppi: tannini condensati e tannini idrolizzabili. I tannini condensati sono polimeri formati da tante unità di flavan-3oli o di flavan-3,4-di oli mentre i tannini idrolizzabili sono poliesteri dell’acido gallico e dell’acido ellagico.

Alcuni dei tannini condensati (rappresentati principalmente dalle antocianidine) sono dotati della capacità di svolgere un ottimo effetto scavenger cioè di ripulitura dai radicali liberi (perossidi) oggi chiamati in causa nella maggior parte delle patologie vascolari e degenerative: sembra pertanto utile che questi tannini rimangano negli sfarinati di carrube per il loro alto valore salutistico. Per quanto riguarda invece la componente tannica rappresentata da monomeri a basso peso molecolare quali la epigallocatechina-3-gallato (EGCG) e la epicatechina-3gallato (ECG) si prevede una loro estrazione e purificazione poiché potrebbero trovare impiego come antitumorali in relazione alla loro capacità di bloccare lo sviluppo tumorale e i processi angiogenetici indispensabili a tale crescita.
La EGCG, infatti, presente nel tè verde, ha dimostrato di possedere tali attività (90-92).

I nostri studi si sono concentrati sull’analisi chimica dei composti presenti nella farina ottenuta da baccello con il particolare intento di:

1) estrarre e purificare i tannini presenti sia con sistemi tradizionali che con metodiche innovative,

2) saggiare le attività biologiche dei suddetti tannini con l’intento di definire in particolare le capacità antiproliferative cellulari delle catechine.

Nel presente lavoro si riportano i risultati delle prove da noi condotte con le due epicatechine EGC ed EGCG che si sono dimostrate capaci, quando applicate in vitro su cellule tumorali epatiche di topo, di indurre una attività antiproliferativa e di attivare i processi apoptopici cellulari.

Gli esperimenti si sono articolati in due fasi sucessive.
1) Individuazioni dei composti catechinici presenti nella farina di carrube.
2) Valutazione dell’attività antiproliferativa dei composti catechinici in colture cellulari di tumore epatico (T1 celi line) di topo.

Sintesi dell’intervento presentato al convegno “Il Carrubo, situazione attuale e prospettive di sviluppo” tenutosi a Ragusa il 28 dicembre 2001, copia del testo integrale può essere richiesto al Consorzio Politec A.R. Piazza Ancione 2, Ragusa

 MATERIALI E METODI

 

Campionamento:

Campioni di carrube sono stati raccolti nelle zone della Sicilia orientale (Ragusa) durante il periodo di agosto e settembre. I campioni di baccelli sono stati mantenuti a temperatura ambiente ed analizzati entro due o tre mesi dalla raccolta.
I baccelli privati dei semi sono stati polverizzati con un mulino meccanico e le singole polveri sono state estratte come descritto di seguito.


Il tè verde ed il tè nero risultano le principali fonti di catechine e teoflavine e pertanto si è provveduto ad utilizzare estratti di due suddetti tè come prodotti di confronto.

Prove analitiche:

Preparazione degli standard

Le soluzioni iniziali di tutti gli standard sono state preparate sciogliendo quantità pesate degli analiti nella fase mobile utilizzata per la separazione comatografica (H20: acido fosforico 0,5%: acetonitrile: metanolo 68:22:4:6).

Le catechine, l’acido gallico, la caffeina e la teofillina furono preparate alla concentrazione di 10 mg/ml; l’acido clorogenico alla concentrazione di 25 mg/ml;

l’acido caffeico alla concentrazione di 30 mg/ ml; il catecolo alla concentrazione di 80 mg/ml e l’estratto di tè alla concentrazione di 25 mg/ ml. La miscela degli standard per la calibrazione è stata preparata diluendo le suddette soluzioni madri nella stessa fase mobile a concentrazioni che andavano da 0,25 a 500 (J.g/ml. Le soluzione madre e la miscela degli standard sono state conservate al buio a -20° C.

Estrazione e preparazione dei campioni

I campioni furono preparati infondendo un g di tè o di farina di carrube in 100 ml di acqua bollente per 15 min. L’infusione è stata centrifugata a 13.000 rpm per 10 in ed il sopranatante filtrato in successione prima attraverso filtri di acetato di cellulosa da 0,45 poi da 0,22 p.m. Una seconda estrazione è stata eseguita sulla, pellet ottenuta dalla centrifugazione.
 

Separazione cromatografica

Le separazioni sono state condotte utilizzando una colonna RP da a 40 °C e una fase mobile costituita da N20 (68%), 0,5% acido fosforico (22%), acetonitrile (4%) e metanolo (6%) a gradiente lineare aumentando i solventi organici.

Il flusso era di 1,0 ml/min e l’eluato è stato continuamente analizzato a 205 nm mediante un detector photodiodoarray.

Di tutti i composti si è ottenuta una buona linearità a tutte le concentrazioni testate con coefficienti di correlazione di 0,992-0,999.

Il metodo è stato quindi utilizzato per l’analisi di infusi di foglie di tè verde, tè nero e di farina di carrube (Ceratonia siliqua).
 

Apparto cromatografico

La separazione cromatografica è stata fatta con un sistema HPLC utilizzando una colonna Microsorb RP- Cis 100 A (250 x 4,6 mm) mantenuta in un bagno d’acqua a 40° C. Il sistema HPLC consisteva di una pompa quaternaria (Lachrom L-7100), un iniettore rhodyne e un detector Diode Array L-7455. I dati sono stati analizzati con un sistema computerizzato (Merk-Hitachi, Germania). I picchi nei campioni sono stati identificati comparando i loro tempi di ritenzione con quelli degli standard. I cromatogrammi degli standard sono riportati nella Fig. 1.

Fig. 1 – Cromatogramma a l=205nm della miscela standard (25 mg/ml CIAc; 15 mCac; 50 mg TFs; mg/ml di tutti gli altri analiti). Le condizioni cromatografiche sono descritte nel testo (I.A.U.=0,5 Volt.) C: (+)catechina; EC: (-)epicatechina; EGCG: () epigallocatechina-3-gallato; ECG: (-)epicatechina-3-gallato; EGC: (-)epigallocatechina; Gac: acido gallico; T: teofillina; CA:
caffeina; CIAc: acido clorogenico; Cac: acido caffeico; Ct: catecolo; TFs: teoflavine.

 Prove Biologiche:

Colture cellulari

Le colture cellulari tumorali (T1) utilizzate negli esperimenti derivano da carcinoma epatocellulare di topi transgenici nei quali è stata indotta una sovraespressione dei geni c-myc e TGF. Le cellule sono state mantenute in terreno di coltura DMEM senza L-glutammina, HAM F 12 contenente galattosio 1 mg/mL , HEPES 18 mM, Na piruvato 5 mM, prolina 30 mg/MI, ITS 100 X, glutammina 2 mM, gentamicina 0,1% (Sigma-Aldrich, Italia) e aggiunto di FBS 10%. Le linee cellulari sono state coltivate in piastre di polistirene (Dasit, Italia).

Densità cellulare

E’ stato utilizzato l’emocitometro, che consiste in un vetrino munito di una griglia speciale, ideato da Neubauer: 20 mL di cellule in sospensione sono stati collocati su questo vetrino e osservati al microscopio Nikon con un ingrandimento 40X.

Per valutare la vitalità delle cellule piastrate è stato usato il metodo di esclusione del colorante: 100 ]xL di cellule sono stati trattati con 100 ^L di una soluzione di Trypan Blue (Sigma) allo 0.2% peso/volume in PBS sterile per 5 minuti.
Si sono prelevati 20 µL di questa soluzione e sono stati osservati all’emocitometro: le cellule morte appaiono azzurre perché hanno perso l’integrità di membrana e hanno inglobato il colorante.
 

Saggio di proliferazione cellulare

Le colture cellulari sono state incubate cronicamente con derivati catechinici. I trattamenti sono stati eseguiti per 24 ore in piastre da 24 e 96 pozzetti. Nel primo caso si è utilizzata una densità cellulare di 0.25x104 cellule/mL. Nel secondo caso invece la concentrazione delle cellule seminate è stata di 5x103 cellule/mL Raggiunto il giusto grado di confluenza (arca il 60%), per la piastra a 24 pozzetti si è proceduto alla somministrazione dei composti. Sono state utilizzate tré concentrazioni crescenti di epichatechina-3-gallato (ECG) (80 ug/mL; 160 ^g/mL; 320 u.g/mL).

Le piastre sono state poste poi in incubatore per 24 ore. Il trattamento è stato effettuato in triplo in tre esperimenti successivi.

Le piastre a 96 pozzetti sono state trattate con diverse concentrazioni di catechine.

Ogni trattamento con i rispettivi controlli, è stato eseguito in quintuplo in 3 successivi esperimenti. Al termine del trattamento le piastre sono state poste ad incubare per 24 ore.

Valutazione dell’attivazione della caspasi 3.

L’attività proteasica della caspasi 3 nei lisati di cellule è stata determinata utilizzando un kit della Promega. Le cellule T1 sono state trattate con EGCG ed ECG (80 µg/mL) da sole o in associazione con un inibitore delle caspasi (ZVAD-FMK) per 24 o 48 ore. E’ stato poi aggiunto un substrato colorimetrico (DEVD-pNA) in grado di evidenziare l’attività delle proteasi e previa incubazione a 37°C per 4 ore è stata letta l’assorbanza a A, 405 nm in modo da quantificare l’attività proteasica stessa.
 

Visualizzazione delle cellule

Nello stesso giorno, la piastra a 24 pozzetti con le cellule trattate è stata osservata con un microscopio Nikon Diaphot ad un ingrandimento 40X.

Le aree per la riproduzione fotografica di ogni singolo trattamento sono state scelte in modo casuale e quindi fotografate, con un apparecchio Nikon appositamente installato sul microscopio.

Sono state eseguite almeno tré fotografie di aree diverse di ogni singolo trattamento, in modo che l’effetto notato fosse attribuibile alle sostanze utilizzate e non ad una diversa densità di crescita dovuta ad un eventuale errore durante il piastraggio.

 RISULTATI E DISCUSSIONE

Per quanto concerne i risultati ottenuti in questa sperimentazione è stato possibile mettere in risalto che nel baccello di una tipica pianta mediterranea quale il carrubo sono presenti buone quantità di polifenoli rappresentati prevalentemente da catechine (acido gallico, () epicatechina gallato, (-)epigallocatechina gallato). Tali catechine sono state separate e purificate mediante analisi cromatografìa (HPLC).
La loro quantità, come si vede dalla tabella 1, è pari a 2,57 mg/g di farina di carrube.

Le prove biologiche condotte utilizzando le suddette catechine hanno evidenziato una marcata riduzione della proliferazione cellulare in modo dose-dipendente su colture cellulari tumorali epatiche. Tale riduzione risulta maggiore per i trattamenti a 48 ore rispetto ai trattamenti eseguiti a 24 ore (Figura 2). Per quanto riguarda l’attività sull’induzione dell’apoptosi tramite attivazione della caspasi 3 è risultato che le catechine esercitano un significativo incremento di attività proteasica e quindi di attività apoptotica rispetto alle cellule non trattate (Figura 3).

Dai suddetti dati si può concludere che sia conveniente l’estrazione delle catechine presenti nella farina di carrube per ottenere formulazioni di tipo farmaceutico nonché prodotti di tipo no-food utilizzati come integratori alimentari. Un grande vantaggio nella possibile utilizzazione degli estratti di carrube rispetto agli estratti di tè verde è rappresentato dall’assenza nei primi di sostanze ad attività eccitatoria sul sistema nervoso centrale per cui si possono evitare i costosi processi di decaffeinizzazione.

Esiste una fiorente letteratura riguardante l’utilizzo di diete a base di frutta e verdura nella prevenzione dei tumori soprattutto localizzati nel tratto gastroenterico, tale indicazione rimane però ancora genericamente ancorata alla presenza nei vegetali di numerosi composti capaci di interferire sulle capacità del sistema microsomiale epatico di attivare sostanze a potenziale attività tumorigena presenti negli alimenti e nell’ambiente.
L’individuazione della presenza di composti ben caratterizzati chimicamente nel mondo vegetale capaci di esercitare una precisa attività sulla proliferazione cellulare e sui processi di attivazione dell’apoptosi appare come l’unica via per concretizzare in modo convincente la capacità di prevenire la formazione di tumori determinando i meccanismi d’azione dei composti estratti e purificati da matrici vegetali.
L’individuazione della presenza di quantità elevate di polifenoli nel carrubo ed in particolare di catechine capaci di inibire in vitro la proliferazione tumorale cellulare appare un fenomeno positivo nella ricerca di sorgenti di composti utilizzabili nella prevenzione. I tannini estratti dalle farine possono trovare utilizzazioni industriali nella creazione di prodotti no-food utilizzabili a scopo salutistico.



Tab. 1. Concentrazione di catechine nella farina di carrubo:

EGC = epigallocatechina;

EGCG = epigallocatechina-3-gallato;

ECG = epicatechina-3-gallato.

Fig. 2 – Inibizione della proliferazione cellulare di ECG

Fig. 3 – Attività proteasica (caspasi 3) sulle cellule T1 dopo trattamento con ECG ed EGCG (80 mg/ml) per 48h.

 CONCLUSIONI

L’impegno profuso da molti ricercatori nella lotta contro il cancro, ha portato negli ultimi anni ad un’elevata conoscenza dei fenomeni biologico-molecolari che contraddistinguono questa patologia, con ottimi risultati sia in campo terapeutico che preventivo.

Purtroppo, il diverso fenotipo neoplastico, la difficile diagnosi precoce e l’inefficacia o la tossicità collaterale di molti chemioterapici, rendono molte tipologie tumorali ancora una delle cause maggiori di morte nell’uomo. Risulta quindi necessaria la ricerca di nuove forme di trattamento, prevenzione e diagnosi da affiancare alle terapie tradizionali, in modo da ottenere una vasta gamma di strumenti per riconoscere e combattere la malattia.

In tale ottica possono risultare importanti i prodotti di origine naturale, come il tè verde e i prodotti del carrubo i quali contengono numerosi principi attivi polifenolici, in particolare i derivati catechinici, che sono in grado d’interagire la formazione e la progressione della proliferazione cellulare tumorale.

L’ECG ha mostrato una significativa capacità antiproliferativa; in particolare, la diminuzione della proliferazione si è ottenuta alla concentrazione di 80 µg/mL, mentre per le concentrazioni di 160, 320 e 442 µg/mL, si è ottenuto un arresto completo dell’attività proliferativa ed un incremento concentrazione dipendente della morte cellulare. Se l’effetto antiproliferativo esercitato dall’ECG 80 µg/mL sia dovuto più ad un incremento della morte o più ad un’azione sul ciclo cellulare rimane da chiarire, anche se gli effetti riscontrati alle dosi maggiori lasciano supporre che la morte cellulare giochi il ruolo predominante.


Gli esperimenti eseguiti ci portano a concludere che l’azione dell’ECG e delle EGCG sulla proliferazione cellulare avvenga per interazione sui sistemi di apoptosi anche se non si possono escludere al momento altri meccanismi. Nonostante siano necessari ulteriori studi per capire il meccanismo di azione delle catechine, la presenza di composti naturali in grado d’interagire con la proliferazione tumorale, possono essere validi strumenti per disegnare nuove strategie terapeutiche e diagnostiche, nella cura e nella prevenzione delle patologie tumorali.

Per la bibliografia si rimanda al lavoro originale presentato dal Prof. M. Baraldi al Convegno del 28 dicembre 2001.

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